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隐式口袋闭环验证执行参考

本参考用于把“隐式口袋发现工作流”从案例设计推进到一次可复核的 L0-L3 闭环验证。当前闭环不要求用户手工搭建 OpenFold3、GROMACS、PocketXMol 或 FEP 环境；所有计算应从 WA-DD Web 界面提交，并把中间结果登记为项目资产。

部署基准（2026-08-23 更新）：闭环验证以 server6（http://123.207.15.89:45103）为唯一权威部署。最初记录的项目 cryptic-pocket-kras-g12c（2efb08b2-902e-42e7-afd1-4111c2928831）及其任务运行在旧实例上，迁移到 server6 后只保留了资产副本（cryptic-pocket-kras-g12c imported，属 jhu 用户），任务历史没有迁移，且跨用户资产不能直接引用。KRAS L0 已在 server6 上按 admin 账户重建：项目 cryptic-pocket-kras-g12c-l0（ID 55779f1a-8b2d-4eba-92c9-0b2e635900f4）。下文第一阶段/第二阶段的资产与任务 ID 均以 server6 新记录为准。

1. 验证目标

以 KRAS G12C 为模式靶点，验证 WA-DD 是否能完成以下闭环：

  1. 导入并准备 APO 与 OPEN 对照结构。
  2. 用 OpenFold3 生成候选构象。
  3. 用 GROMACS pocket_discovery 验证候选口袋，并输出标准 pocket 资产。
  4. 用 PocketXMol 基于 pocket 资产生成候选分子。
  5. 用 OpenFold3 复合物预测和 FEP 结果判断候选分子的结合优势。

2. 成功标准

一次闭环验证完成时，应能从同一个项目中导出以下证据：

层级 必需输出 通过标准
L0 基准验证 4OBE、6GJ8 的蛋白/准备后蛋白资产；ARS-1620 类似物配体资产；两组 FEP 结果 同一配体对的 ΔΔG 在 OPEN 构象上优于 APO 构象 1.0 kcal/mol 以上（见第 10 节方法学说明：当前 FEP 仅支持 RBFE，构象间比较通过同配体对双 RBFE 差值实现）
L1 AI 预测 OpenFold3 候选构象资产；与 6GJ8 Switch II 区域的 RMSD 对比表 至少 1 个候选构象 RMSD < 3.0 Å
L2 物理验证 GROMACS md_result 资产；pocket_analyzer_report.json、pocket_events.csv、pocket_volume.csv；标准 pocket 资产；动态口袋集合 pocket_ensemble 资产 AI 候选构象 RMSD 漂移 < 2.0 Å，且口袋事件与体积曲线支持口袋打开
L3 闭环发现 PocketXMol 候选分子 SDF；OpenFold3 复合物预测结果；Top 3 FEP 结果 至少 1 个新分子 ΔΔG < 0

3. 执行前检查

  • [x] 登录 WA-DD Web（server6），进入本次验证专用项目。当前项目：cryptic-pocket-kras-g12c-l0（55779f1a-8b2d-4eba-92c9-0b2e635900f4，admin 账户）。最初记录的旧实例项目 cryptic-pocket-kras-g12c（2efb08b2…）任务历史未迁移，已作废。
  • [ ] 在“模型仓库”确认 OpenFold3 和 PocketXMol 模型处于可用状态。
  • [x] 确认 FEP worker 可接收任务。2026-08-23 已完成三项引擎修复并部署（映射 Kabsch 对齐精修与 1.0 Å 上限、受体冲突预检/ALA 截断修复、LBFGS 副本最小化），并在 PI3KA H1047R 体系上完整跑通正式 RBFE（任务 42bdf7f8，ΔΔG = 19.02 ± 10.60 kcal/mol，10.3 小时）。
  • [ ] 在“任务”或对应页面确认 GROMACS worker 可接收 pocket_discovery 任务。
  • [ ] 确认任务输出中的文件按钮、资产详情文件按钮和“打包下载全部输出”均可打开或下载。

4. 第一阶段：基准资产准备（server6 重建版）

以下资产已在 server6 项目 cryptic-pocket-kras-g12c-l0 中重建（旧实例的同名资产 ID 作废）：

  • [x] 项目创建：cryptic-pocket-kras-g12c-l0（55779f1a-8b2d-4eba-92c9-0b2e635900f4）。
  • [x] PDB ID 导入 4OBE：KRAS_G12C_APO_4OBE（b278fdb6-d2f7-4ce6-9e18-a406f591a00a）。
  • [x] PDB ID 导入 6GJ8：KRAS_G12C_OPEN_6GJ8（27d0ae9a-376c-4c52-82ad-0b387c806cd7）。
  • [x] 默认蛋白准备：KRAS_G12C_APO_4OBE_prepared（22cd397a-a061-4800-a836-115755b2e8d8）、KRAS_G12C_OPEN_6GJ8_prepared（8757b7f4-3d1a-49e2-ae57-ed6bbb95ffac）。
  • [x] 关键经验：FEP 受体必须去除辅因子。 默认准备产物保留晶体中的 GDP/GCP、Mg²⁺（以及 6GJ8 的共价抑制剂片段 F0K），amber14 无法参数化。已用蛋白准备的“组分清理”（component_cleanup.delete_components）重建裸受体：
  • KRAS_G12C_APO_4OBE_bare（7e231289-0cf2-41f9-b7e6-f5c3a58fae7c，删除 GDP×2、MG×2）
  • KRAS_G12C_OPEN_6GJ8_bare（28a78f48-f1c6-4420-8fa4-8dcc6b5ba331，删除 F0K、MG、GCP）
  • 2026-08-23 起 FEP worker 会对含辅因子的蛋白直接快速报错并给出删除指引，不再深埋在模板错误里。
  • [x] 三分子 RBFE 库（SMILES：ARS-1620、Sotorasib/AMG510、Adagrasib/MRTX849）：KRAS_G12C_inhibitor_RBFE_library（c64a9108-02e8-4f9b-9632-1dab1c4ef9a2）。
  • [x] 关键经验：FEP 输入库必须用“FEP/MD 用途”（target_use: “fep_md”）做配体准备。 默认选项的产物缺少 FEP 参数化所需电荷，OpenFE 会退回到 am1bcc 并因缺少 AmberTools 失败。正式库：KRAS_G12C_inhibitor_RBFE_library_prepared_fep（3147fa97-80c6-46ff-a507-29e2cbfb9f89）。普通版 …_prepared（87cc5e32…）保留作对照，不用于 FEP。
  • [ ] 在项目资产列表复核 4OBE、6GJ8、裸受体和 FEP 库资产均可打开详情、下载原始文件。

5. 第二阶段：L0 FEP 基准验证（server6）

历史记录（旧实例）：两个单配体 smoke FEP 完成但 edges=[]，只能证明链路可用；旧正式 L0 RBFE 两个任务失败，错误未保留。旧实例任务 ID（933fcfb0、64d8677d、61151b6d、c54d40c2）在 server6 上不存在。

server6 重启过程（2026-08-23，全部失败原因都已代码化修复或参数规避）：

  • [x] 尝试 1（默认选项正式 RBFE）：秒级失败——kartograf 映射含元素变化（ARS-1620 与 Sotorasib/Adagrasib 有 Cl/F 等取代差异），默认拒绝。结论：这组配体需要勾选“允许元素变化映射”。
  • [x] 尝试 2（允许元素变化）：失败——默认配体准备产物缺电荷，OpenFE am1bcc 无可用工具链。改用 fep_md 准备选项。
  • [x] 尝试 3（fep_md 库 + 默认 prepared 蛋白）：失败——蛋白含 GDP/GCP/MG/F0K，amber14 模板错误；且默认准备产物末端为“链内式”（缺 H1/H2/H3、OXT）。重建裸受体蛋白。
  • [x] 2026-08-23 FEP worker 加固（已部署 amd_cu128_20260823）：辅因子预检快速报错、末端不完整自动 PDBFixer 重建、PDBFixer 重建的未解析侧链冲突自动截 ALA。两个裸受体均通过 amber14 模板化验证。
  • [x] 正式 L0 APO RBFE：已完成（2026-08-24 09:26 CST，任务 L0_RBFE_APO_4OBE_bare_KRAS_lib_fep，job ID 6273dcd5-5bf1-4bcb-88fc-a539ce792622，总耗时约 11 小时，2 条 edge 全部 completed）：
  • ARS-1620 → Sotorasib/AMG510：ΔΔG = -99.15 ± 7.68 kcal/mol（仅 11 对原子映射，微扰横跨两个分子的大部分结构；数值物理上不可信，仅证明链路可跑通）
  • ARS-1620 → Adagrasib/MRTX849：ΔΔG = -7.48 ± 2.95 kcal/mol（16 对映射，量级可解释，是 L0 对比中唯一有解释价值的一条边）
  • 已据此开发"低可靠性标注"（映射 < 12 对或 |ΔΔG| > 15 kcal/mol 时在结果 mapping 里写入 reliability: low 提示，提交 7a55400，镜像 amd_cu128_20260824/thor_20260824 已构建，server6 待恢复后部署）。
  • [x] 正式 L0 OPEN RBFE：已完成（任务 484407ba-ccfa-4017-94b0-f75ea8741cec，2 条 edge 全部 completed；期间 server6 外部网络故障未影响容器内计算）：
  • ARS-1620 → Sotorasib/AMG510：ΔΔG = 3.1e+13（12 对映射，MBAR 完全发散，物理上无意义，仅证明链路可跑通）
  • ARS-1620 → Adagrasib/MRTX849：ΔΔG = -9.39 ± 7.02 kcal/mol（19 对映射，可解释）
  • [x] L0 判定（以 Adagrasib 边为准）：ΔΔΔG = ΔΔG(OPEN) − ΔΔG(APO) = -9.39 − (-7.48) = -1.91 kcal/mol，方向支持“更大配体偏好打开构象”的隐式口袋假设；幅度满足 ≥1.0 kcal/mol 标准，但合并误差约 ±7.6 kcal/mol，统计上不显著。结论：L0 工程链路通过（两次正式 RBFE 全流程完成、可复现）；科学信号方向一致但不确定度大，需以更长采样或更小微扰的配体对（非共价体系）加强。Sotorasib 边（APO -99 / OPEN 发散）映射过小，不参与判定。
  • [ ] 后续加强（可选）：用 PI3KA H1047R 等非共价体系或更同源的配体对重做 L0 基准，降低 ΔΔΔG 不确定度。
  • [ ] 科学注意：ARS-1620 系列为共价 KRAS G12C 抑制剂，本闭环以非共价结合态做 RBFE；若 Adagrasib 边结果不收敛或误差过大，按原计划改选非共价体系做 L0 基准（候选：PI3KA H1047R，已于 2026-08-23 全流程跑通）。

5.1 L0 跑通流程（server6 实测，可复现）

  1. 蛋白：PDB ID 导入 4OBE、6GJ8 → 蛋白准备。默认准备会保留 GDP/GCP、Mg²⁺（及 6GJ8 的共价片段 F0K），FEP 不能用；需在蛋白准备的“组分清理”中删除这些组分，产出裸受体（4OBE：GDP×2 + MG×2；6GJ8：F0K + MG + GCP）。FEP worker 2026-08-23 起会对含辅因子的蛋白直接报错并列出组分名。
  2. 配体库：三个抑制剂的 PubChem Canonical SMILES 建 SDF 库 → 配体准备时必须选择“FEP/MD 用途”（target_use: fep_md），普通准备产物缺电荷，OpenFE 会失败。
  3. FEP 提交参数（实测可跑通组合）：reference 配体 ARS-1620；映射策略 Kartograf + 最大 3D 偏移 0.75 Å；构象对齐自动（内部含 O3A + 映射原子 Kabsch 精修）；勾选“允许元素变化映射”（ARS-1620 与 Sotorasib/Adagrasib 有 Cl/F 取代差异，不勾会在任务早期被拒）；11 个 λ 窗口；timestep 1 fs；minimization 50000；equilibration 50000 步；production 250000 步（250 ps/窗口）。单任务约 11 小时（含每边的复合物腿 + 两条溶剂腿与 MBAR 分析）。
  4. 结果解读：优先看 mapped_atoms 数量；映射少于 12 对或 |ΔΔG| > 15 kcal/mol 的边只作为链路验证，不作为化学结论。

6. 第三阶段：L1 OpenFold3 构象生成

  • [ ] 前置条件已具备：L1 曾因 openfold3 worker 的 AssetFile.size 字段 bug 失败（旧实例任务 4c1a97e9、3176f6cd）。修复提交 a43b816（2026-08-20）已包含在 server6 当前 openfold3 镜像（amd_cu128_20260820，构建于修复之后），可直接重试。
  • [ ] 在“结构预测”选择 server6 项目里的 4OBE 蛋白资产（裸受体 KRAS_G12C_APO_4OBE_bare 或原始 KRAS_G12C_APO_4OBE）作为输入。
  • [ ] 模板扰动预测：使用 6GJ8 相关资产作为模板输入。
  • [ ] 配体诱导预测：配体输入使用 fep_md 准备的库或 bound ligand prepared 资产。
  • [ ] 从 OpenFold3 输出中筛选构象资产，计算 Switch II 区域与 6GJ8 的 RMSD。
  • [ ] 选择 RMSD < 3.0 Å 的构象进入 L2。

7. 第四阶段：L2 GROMACS 物理验证（未开始）

  • [ ] 在“GROMACS / MD”选择 L1 候选构象和 6GJ8 基准构象。
  • [ ] 协议选择 pocket_discovery，使用 5 ns aMD 或当前资源允许的等效参数。
  • [ ] 等待任务完成后，打开 md_result 资产。
  • [ ] 检查 pocket_analyzer_report.json、pocket_events.csv、pocket_volume.csv、代表结构和标准 pocket 资产。
  • [ ] 检查同任务登记的 pocket_ensemble（动态口袋集合）资产；如需对接验证，可在"对接任务"页直接选择它做 ensemble 对接扇出。
  • [ ] 使用“打包下载全部输出”保存完整 MD 与口袋分析结果。

8. 第五阶段：L3 配体生成与复合物验证（未开始）

  • [ ] 在“分子生成”选择 L2 输出的标准 pocket 资产和对应蛋白/构象资产。
  • [ ] 用 PocketXMol 生成 10 个候选分子，生成候选分子 SDF 资产。
  • [ ] 在“结构预测”对 Top 候选分子运行 OpenFold3 复合物预测，生成复合物结构资产。
  • [ ] 在“FEP / 分析”对 Top 3 分子运行 FEP，生成 FEP 结果资产。
  • [ ] 汇总 ΔΔG、口袋事件、体积曲线、复合物结构和候选分子 SDF，形成最终证据包。

9. 需要人工判断的边界

当前平台能完成资产流、任务调度、标准 pocket 资产输出和任务结果打包下载；但以下判断仍需要研究者复核：

  • OpenFold3 候选构象是否代表有效的 Switch II 打开状态。
  • pocket_discovery 输出的候选口袋是否与目标药效团空间一致。
  • RMSD、口袋体积和 FEP ΔΔG 是否足以支持“隐式口袋可药”的结论。
  • 当前 pocket analyzer 是 MVP 几何与事件分析；fpocket、MDAnalysis、水网络和多帧评分增强可提高证据质量，但不阻断本闭环验证。

10. 框架支持现状（2026-08-23）

已支持并验证：

  • RBFE（相对结合自由能）全链路：含自动 O3A + 映射原子 Kabsch 刚性精修、1.0 Å 映射偏差上限、受体重原子冲突预检与显式 ALA 截断修复、辅因子快速报错、末端自动重建、未解析侧链冲突自动截 ALA、LBFGS 副本最小化。PI3KA H1047R 正式 RBFE 已完整跑通（42bdf7f8）。
  • 元素变化映射（allow_mapping_element_changes），KRAS G12C 共价抑制剂系列需要此选项。

尚不支持 / 有边界（影响闭环设计的部分）：

  1. ABFE（绝对结合自由能）未实现：FEP 只有 RBFE 协议，单配体输入只会得到 edges=[] 的 smoke 结果。L0 的“构象间比较”只能通过同一配体对在两个构象上分别跑 RBFE、再比较两个 ΔΔG 的差值（ΔΔΔG）实现；无法直接输出“某配体在某构象上的绝对 ΔG”。
  2. OpenFE 受体只接受 amber14 可模板化的裸聚合链：晶体辅因子（GDP/GCP、Mg²⁺）、共价配体片段（如 6GJ8 的 F0K）必须在蛋白准备阶段删除，等价于在无辅因子/非共价状态下做 FEP；自定义力场参数化的辅因子保留方式暂不支持。
  3. 蛋白准备默认输出为“链内式”末端（缺 H1/H2/H3、OXT）：FEP worker 会在运行时自动重建兜底（2026-08-23 起），但蛋白准备源头修复仍在待办。
  4. 默认配体准备不产生 FEP 可用电荷：FEP 输入库必须选择“FEP/MD 用途”准备变体。
  5. pocket analyzer 深度评分仍未增强：聚类代表构象→pocket_ensemble 已于 2026-08-25 交付；fpocket、MDAnalysis、水网络、逐帧口袋事件评分尚未增强（不阻断闭环，降低证据质量）。
  6. L1 OpenFold3 构象生成策略（模板扰动/配体诱导的参数规范与筛选）尚未实际验证过一轮，属于下一步。