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案例：隐式口袋发现工作流 (Cryptic Pocket Discovery Workflow)

1. 案例构想与科学问题

1.1 背景与挑战

在药物发现中，传统的结构优化工作流（Structure-Based Drug Design, SBDD）通常基于一个静态的蛋白结构（通常是 apo 态或与已知配体结合的复合物）来进行。然而，许多重要的药物靶点，如 KRAS G12C、SHP2 和 BTK，存在一种特殊的结合位点——隐式口袋（Cryptic Pocket）。

隐式口袋的特点是： - 在蛋白的静态结构中（特别是 apo 态）不存在或完全暴露。 - 口袋的形成是配体诱导契合（Induced Fit）的结果，或者来源于蛋白动力学上的稀有构象状态。 - 传统的分子对接（Docking）算法假设蛋白是刚性的，因此系统性地漏掉这类重要的可药位点。

1.2 科学问题

本案例旨在解决以下核心科学问题：

如何构建一个可计算、可验证的闭环工作流，来预测、验证并利用蛋白的隐式口袋？

具体而言，我们探索： 1. 构象系综生成：能否利用 OpenFold3（AlphaFold3 的开源复现版）AI 模型，通过模板扰动和配体诱导策略，生成能代表蛋白"易打开"状态的构象系综（Conformational Ensemble），作为隐式口袋的候选来源？ 2. 物理验证：能否使用分子动力学（MD）模拟，特别是增强采样技术，在物理层面验证这些候选构象是否真的能打开口袋？ 3. 配体诱导闭环：一旦口袋在物理模拟中被验证，能否在这个"打开的"构象上进行配体生成和复合物预测，并通过 FEP 等方法量化其结合优势？

1.3 研究价值

• 科学价值：回答了"AI 预测的构象是否具有物理真实性"这一 AI for Science 领域的核心问题。
• 工程价值：提供了一套自动化的工具链，将隐式口袋的发现从"依赖专家直觉和手工试验"转变为"可重复、可量化的计算流程"。
• 应用价值：为针对 KRAS、MYC 等靶点的 first-in-class 药物设计提供了新的策略。

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2. 工作流设计与任务分解

为了实现上述构想，我们设计了一个包含四个核心阶段的闭环工作流。当前 WA-DD 平台通过现有 OpenFold3、GROMACS、PocketXMol、FEP 和标准资产体系支持这一流程；口袋分析能力作为 GROMACS pocket_discovery 协议的一部分输出标准 pocket 资产。

闭环验证的具体执行步骤见：隐式口袋闭环验证执行参考。

2.1 工作流数据流

graph TD
    A["输入: APO 蛋白结构"] --> B{"阶段 1: OpenFold3 构象系综生成"};
    B -->|"构象系综 (Ensemble of PDBs)"| C{"阶段 2: MD 物理验证 (Gromacs)"};
    C -->|"MD 轨迹 + 代表性 OPEN 构象"| D{"阶段 3: 口袋与水网络分析"};
    D -->|"验证后的 OPEN 构象 (PDB)"| E{"阶段 4: 配体生成与复合物预测 (复用现有)"};
    E -->|"活性配体 + 复合物结构"| F(("科学结论: 隐式口袋的可药性验证"));

2.2 任务分解与组件状态

阶段	任务描述	WA-DD 组件	状态
1. OpenFold3 构象系综生成	利用 OpenFold3 模型，通过模板扰动和配体诱导策略，生成蛋白的多个候选构象。	wa-dd-openfold3	✅ 已接入（AssetFile.size worker bug 已修复，2026-08-20 后镜像可用）；闭环内尚未实测一轮
2. MD 物理验证	使用 GROMACS 对候选构象进行增强采样的 MD 模拟，验证口袋打开。	wa-dd-gromacs (pocket_discovery / aMD / analysis)	✅ 已接入；闭环内尚未实测一轮
3. 口袋与水网络分析	从 MD 输出中提取口袋候选事件、体积曲线和候选口袋结构，注册为标准 pocket 资产；并把聚类代表构象组装为 pocket_ensemble（动态口袋集合）资产，供对接页按口袋扇出。	wa-dd-gromacs 内置 pocket analyzer + pocket ensemble	✅ 已接入（pocket_ensemble 与 ensemble 对接 2026-08-25 上线）；深度 fpocket/MDAnalysis 评分待增强
4. 配体生成与复合物预测	在验证过的 OPEN 构象上生成配体，并通过 OpenFold3 预测复合物结构，FEP 验证。	wa-dd-molecule-gen, wa-dd-openfold3, wa-dd-fep	✅ 已接入；FEP 引擎已加固并于 2026-08-23 在 PI3KA H1047R 上完整跑通正式 RBFE

2.3 OpenFold3 构象系综生成策略

OpenFold3 没有内置 MSA 子采样功能，但通过以下两种互补策略生成构象多样性：

策略	原理	实施方式
模板扰动法	OpenFold3 支持模板输入，不同模板诱导不同构象	对 KRAS G12C 提供 5 个模板：APO (4OBE)、GTP 态 (5VQ2)、GDP 态 (4TQ9)、Switch II OPEN (6GJ8)、随机扰动 APO
配体诱导法	OpenFold3 可直接输入配体预测复合物，不同配体诱导不同构象	输入 KRAS + 已知活性配体 (ARS-1620, MRTX849) + 片段库，预测 ~10 个构象

两种策略结合，可生成约 15-20 个候选构象。

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3. 验证过程（单服务器渐进式方案）

我们将以 KRAS G12C 作为模式靶点来验证这一工作流。KRAS G12C 的 Switch II 区域存在一个经典的隐式口袋，当与共价抑制剂（如 ARS-1620）结合时会打开。

鉴于当前可用资源为单服务器（tc232/server6），我们采用"金字塔式渐进验证"策略，确保每一步都可在短期内完成并产出确定性证据。

3.1 四层渐进验证计划

层级	目标	计算任务	单服务器耗时	验证产出
L0: 基准验证	FEP 能区分 Open vs APO 构象吗？	用 KRAS G12C 已知 OPEN (6GJ8) 和 APO (4OBE) 结构，计算配体 ARS-1620 类似物的 ΔΔG	1-2 天	FEP ΔΔG 结果表（显示 OPEN 构象 ΔG 显著优于 APO）
L1: AI 预测	OpenFold3 能预测出 OPEN 构象吗？	OpenFold3 模板扰动 + 配体诱导，生成 ~15 个候选构象	半天	构象系综 + 与 6GJ8 的 RMSD 对比
L2: 物理验证	AI 预测的构象在物理上稳定吗？	对 AI 最优构象 + 基准构象跑 5ns aMD，对比 RMSD 漂移	1-2 天	MD 轨迹 + RMSD 演化曲线
L3: 闭环发现	AI 发现的构象能诱导配体结合吗？	在 AI 验证构象上，PocketXMol 生成 10 个分子，OpenFold3 预测复合物结构，选 Top 3 跑 FEP	3-5 天	新分子的 ΔΔG < 0（验证可药性）

3.2 各层级详细步骤

L0: 基准验证（Day 1-2）

• 目标：证明 WA-DD 的 FEP 管线能物理区分 OPEN 与 APO 构象。
• 输入：KRAS G12C APO (PDB: 4OBE), KRAS G12C OPEN (PDB: 6GJ8), 配体 ARS-1620 类似物。
• 步骤：
  1. 用 wa-dd-protein-prep 处理 4OBE 和 6GJ8。
  2. 用 wa-dd-ligand-prep 准备 ARS-1620 类似物。
  3. 用 wa-dd-fep 分别计算配体在两个构象上的结合 ΔG。
• 通过标准：OPEN 构象的 ΔG 比 APO 构象优 -1.0 kcal/mol 以上。

L1: AI 预测（Day 3-4）

• 目标：生成能代表 Switch II 区域不同状态的候选构象。
• 输入：KRAS G12C APO (PDB: 4OBE)，平台已接入的 OpenFold3 结构预测能力。
• 步骤：
  1. 用 wa-dd-openfold3 对 4OBE 运行 OpenFold3 模板扰动（5 个模板），生成 5 个构象。
  2. 用 wa-dd-openfold3 对 4OBE 运行 OpenFold3 配体诱导（5 个配体），生成 5 个构象。
  3. 计算每个构象与 6GJ8 Switch II 区域的 RMSD。
  4. 筛选 RMSD < 3.0Å 的候选构象（作为 L2 的输入）。
• 通过标准：至少找到 1 个与 6GJ8 RMSD < 3.0Å 的构象。

L2: 物理验证（Day 5-8）

• 目标：验证 AI 预测构象的物理稳定性。
• 输入：L1 筛选出的 AI 构象 + 6GJ8 基准构象。
• 步骤：
  1. 用 wa-dd-gromacs 的 pocket_discovery / aMD 协议对 3 个构象各跑 5ns 模拟。
  2. 用 GROMACS 内置 pocket analyzer 输出 pocket_analyzer_report.json、pocket_events.csv、pocket_volume.csv 和标准 pocket 资产。
  3. 对比 AI 构象与 6GJ8 的 RMSD 漂移。
• 通过标准：AI 构象的 RMSD 漂移 < 2.0Å（与 6GJ8 相当）。

L3: 闭环发现（Day 9-14）

• 目标：验证 AI 发现的构象可被用于配体设计。
• 输入：L2 验证过的 AI 构象。
• 步骤：
  1. 用 wa-dd-molecule-gen (PocketXMol) 在 AI 构象上 de novo 生成 10 个分子。
  2. 用 OpenFold3 预测"蛋白 + 新配体"的复合物结构（替代原 Uni-Dock 对接）。
  3. 用 wa-dd-fep 计算 Top 3 的 ΔΔG。
• 通过标准：至少 1 个新分子的 ΔΔG < 0（结合比基准配体更强）。

3.3 预期科学发现信号

1. AI 预测能力验证：OpenFold3 通过模板扰动和配体诱导生成的构象中有多少比例能在 MD 模拟中稳定存在，且能观察到口袋打开。
2. 动力学熵贡献：通过对比不同构象的 FEP 结果，量化构象变化对结合自由能的贡献。
3. 水分子角色：分析 MD 轨迹中口袋打开时水分子的进出模式，识别可能的"不利水"（Unhappy Water）。
4. OpenFold3 复合物预测精度：对比 OpenFold3 预测的复合物结构与 FEP 物理验证结果的一致性。

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4. 开发进度

4.1 已完成

• 科学问题定义：明确了隐式口袋发现的科学价值和技术路径。
• 工作流设计：完成了从 OpenFold3 构象生成到 FEP 验证的完整数据流设计，以及单服务器渐进式验证方案。
• 现有组件集成：openfold3、gromacs、molecule-gen、fep 等组件已纳入同一资产链。
• Pocket analyzer MVP：GROMACS pocket_discovery 输出可登记 md_result、候选 pocket 资产和可打包下载的完整结果文件。
• FEP 引擎加固与全流程贯通（2026-08-23，server6）：修复三连环根因（受体原子冲突进入传播、映射原子 3D 偏差过大进入 hybrid topology、openmmtools FIRE 最小化对高应变体系松弛不足），并追加受体温和加固（辅因子预检、末端自动重建、未解析侧链自动截 ALA）。PI3KA H1047R 正式 RBFE 首次完整跑通（任务 42bdf7f8，ΔΔG = 19.02 ± 10.60 kcal/mol），修复已固化为代码（bfba633、1775440、378060f）并部署 amd/thor 双端镜像。
• 动态口袋集合与 ensemble 对接（2026-08-25，133acb5）：GROMACS pocket_discovery 解析 cluster.log 聚类表、拆分聚类代表构象并按构象重新计算口袋残基组成，登记 pocket_ensemble 资产（含聚类占比、每口袋代表结构/口袋 PDB）。对接页口袋选择器可直接选择动态口袋集合，Uni-Dock 按"口袋 × 配体"扇出，pose library 记录 WA_DD_POCKET_* 属性并输出跨口袋共识排序；MD 派生 md_structure 也可直接作为对接/生成受体。amd/thor 镜像已构建并部署 server6。

4.2 进行中

• KRAS G12C L0 基准验证（server6，已完成 2026-08-24）：L0 两个正式 RBFE 全流程跑通（APO 6273dcd5、OPEN 484407ba，可复现流程见执行参考 5.1 节）。Adagrasib 边 ΔΔΔG = -1.91 kcal/mol（OPEN 优于 APO，方向支持隐式口袋假设；合并误差 ±7.6，统计不显著，需更长采样或更同源配体对加强）。Sotorasib 边两次结果均发散（-99 / 3e+13），已触发“低可靠性标注”开发（7a55400，已部署）。
• OpenFold3 构象生成验证：AssetFile.size worker bug 已修复（a43b816，2026-08-20 后镜像包含），模板扰动和配体诱导预测待在 server6 重提并筛选——这是闭环的下一步（L1）。

4.3 规划中

• Pocket analyzer 深度增强：聚类代表构象→pocket_ensemble 已交付（见 4.1）；在标准 pocket 资产合同不变的前提下，继续补充 fpocket、MDAnalysis、水网络和逐帧口袋事件评分。
• 案例验证数据：用 KRAS G12C 示例补齐 L0-L3 的实际输出、截图和阈值证据。
• 蛋白准备源头修复：默认准备产物输出链内式末端（缺 H1/H2/H3、OXT）；当前由 FEP worker 运行时兜底重建，源头修复待做。
• ABFE 评估：当前 FEP 仅支持 RBFE，构象间比较依赖同配体对双 RBFE 差值；如需绝对 ΔG 需评估引入 ABFE 协议。

4.4 里程碑

时间	里程碑	状态
第一阶段 (Week 1)	用 wa-dd-openfold3 跑通 L1 构象生成和候选筛选。	待开始（bug 已修复，可重试）
第二阶段 (Week 2)	用 wa-dd-gromacs 跑通 L0 基准 FEP + L2 物理验证。	✅ L0 完成（2026-08-24，APO+OPEN 两个正式 RBFE 全流程，ΔΔΔG = -1.91 kcal/mol 方向正确但不确定度大）；L2 待 L1 产出
第三阶段 (Week 3)	基于 GROMACS pocket analyzer 输出标准 pocket 资产并跑通 L3 闭环发现。	待开始
第四阶段 (Week 4)	增强 fpocket/MDAnalysis 评分、补齐水网络分析和完整案例证据。	待开始
(2026-08-23 插入)	FEP 引擎加固 + PI3KA 全流程贯通。	✅ 完成

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5. 平台界面操作与资产流

当前案例面向 WA-DD 已部署实例。普通用户不需要手工安装 OpenFold3、下载模型权重、编写 Dockerfile 或进入容器执行命令；这些属于平台组件运维范围。案例中的 L0-L3 工作应尽量通过 Web 界面完成，并把每一步输出登记为项目资产。

5.1 界面入口

工作	页面入口	主要输入	主要输出
结构准备	蛋白处理	PDB ID 或上传 PDB/CIF	protein / prepared_protein 资产
配体准备	配体处理	SDF、SMILES、表格或手绘分子	ligand / prepared_ligand 资产
构象生成	结构预测	蛋白资产、模板/配体诱导参数	OpenFold3 结构结果资产
MD 与口袋分析	GROMACS / MD	蛋白/复合物/拓扑/轨迹资产，pocket_discovery 协议	md_result、pocket_analyzer_report.json、pocket_events.csv、pocket_volume.csv、标准 pocket 资产、动态口袋集合 pocket_ensemble 资产
分子生成	分子生成	标准 pocket 资产和生成约束	候选分子 SDF 资产
FEP 验证	FEP / 分析	同系列配体、复合物或对接/生成结果	FEP 结果表和可下载结果资产

5.2 标准资产衔接

• GROMACS pocket_discovery 会把口袋分析结果写入同一个任务输出，并在存在代表结构时生成标准 pocket 资产。
• pocket_discovery 同时登记 pocket_ensemble（动态口袋集合）资产；“对接任务”页的口袋选择器可直接选择它，无需再选蛋白，系统按每个口袋的聚类代表构象扇出对接，并在 pose library 中标注口袋来源与聚类占比。
• 标准 pocket 资产可直接被“对接任务”和“分子生成”页面选择，不需要手动复制中心坐标或文件路径。
• 任务右上角的输出按钮会列出任务登记的资产；“打包下载全部输出”会下载该任务的全部结果文件。
• 每个结果文件仍可在资产详情中单独打开或下载，适合检查 json、csv、xvg、pdb、gro、log 等输出。

5.3 仍需人工判断的部分

平台可以完成数据流和计算调度，但隐式口袋案例仍需要研究者根据科学问题做筛选：

• 选择 APO、OPEN、配体诱导或模板扰动构象作为对照。
• 判断 RMSD、口袋体积、候选残基和 FEP ΔΔG 是否支持“口袋可药”结论。
• 对当前 MVP pocket analyzer 的几何候选口袋进行人工复核；更深入的 fpocket、MDAnalysis、水网络和多帧事件评分仍属于后续增强。